上海某药公司克拉霉素控制菌检测中大环内酯酶用量的 验证实验

2022-01-06

一、概述
根据新版 GMP 要求，控制菌检查产品抑菌性可选择适宜的中和

剂。本方案根据客户提供的抗生素，选用大环内脂酶作为中和剂进行 控制菌验证试验。
1.1 胰酪大豆胨液体培养基(TSB)

1.2 大环内脂酶

1.3 供试品 克拉霉素片（批号608615U）

1.4 供试菌
大肠埃希菌:CMCC 25922，浙江省微生物研究所 1.5 一次性使用平皿

  来源:江苏康健医疗用品有限公司

规格:Φ90 mm，环氧乙烷灭菌 二、验证目的

  验证大环内酯酶消除克拉霉素片抑菌性的使用量。

三、试验要求
1)供试菌稀释液浓度:50~100 cfu 2)试验组菌液培养箱培养 3 后菌体应生长良好。

四、验证前准备 4.1 文件确认

对支持本次验证操作及管理类文件进行确认，确保验证前与本次 验证相关的文件均已经过批准。检查验证结果记录在附件 1《文件确 认表》中。
4.2 仪器设备确认

检查所涉及的设备是否符合试验要求，确认结果填写在附件 2《设 备确认表》中。

4.3 试验用菌种确认 检查所涉及的试验用菌种是否符合要求，确认结果填写在附件 3

《试验用菌种确认表》中，可接受标准:菌种形态特征应良好，菌种 代数不得超过 5 代。
五、验证过程
5.1 菌液制备

接种大肠埃希菌至 TSB 培养基中，接种量 5%，32°C培养 18~ 24 小时，用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释大肠埃希菌至 10-8。
5.2 抗生素供试品的准备

称量克拉霉素片 5g，研钵研磨呈粉末状，加入 50 mL 的 NaCl- 蛋白胨缓冲液，得到 1:10 的克拉霉素供试液，静置 1 小时;

5.3 加酶培养基溶液的制备
向大环内酯酶中加入 1 mL 无菌水溶解酶冻干粉，制成酶溶液。 配制 5 瓶 1L LB 培养基溶液，121°C高压灭菌 20 min，灭菌结束

待降温后放置超净台中备用。向培养液中分别加入不同梯度的大环内 脂酶液，制备成梯度添加量大环内脂酶加酶培养基溶液。
5.4 试验组

1)向加酶培养基溶液中分别加入 10mL 抗生素上清溶液;

2)向上述培养基溶液中分别加入 100μ L 供试菌稀释液，放置培 养箱中 32°C培养 3 天，观察结果并记录。
5.5 阴性对照组

1)向培养基溶液中分别加入 10mL 抗生素上清溶液;

2)向上述培养基溶液中分别加入 100μ L 供试菌稀释液，放置培 养箱中 32°C培养 3 天，观察结果并记录。
5.6 菌液组

向培养基溶液中加入 100μ L 供试菌稀释液，放置培养箱中 32°C 培养 3 天，观察结果并记录。
5.6 可接受标准

试验组菌液培养箱培养 3 天后菌体应生长良好，否则需要改变大 环内脂酶加酶量，重新进行试验。
六、验证结果评价

对验证结果进行综合评定的内容包括但不限于以下方面:1验证 试验是否有遗漏;2是否需要进一步补充试验;3验证记录是否完整;

4试验结果是否符合标准要求。试验结果记录在附件 4《验证结果记

录表》、附图 1《验证结果》、附图 2《验证结果》中。

附件 4:《验证结果记录表》

验证结果记录表

雅培制药控制菌实验验证

抗生素种类/批号:克拉霉素片(250 mg/片)/ 608615U 酶种类/批号:大环内脂酶/210302D
第一次验证	菌液组	阴性组	2 支/瓶	/	/
结果	++	--	++	/	/
第二次验证	菌液组	阴性组	0.5 支/瓶	1 支/瓶	2 支/瓶
结果	++	--	--	+	++
结果评定: 大环内脂酶 2 支可以消除克拉霉素片对大肠埃希菌的抑菌性。
确认人/日期: QA 复核人/日期:

注:表中“++” 表示菌体生长良好，“+”表示菌体生长，“--”表示未长菌。