阿奇霉素片和罗红霉素胶囊微生物限度检查中大环内酯酶用量的验证实验

2022-01-10

一、概述 本方案采用薄膜过滤法，验证大环内酯酶消除阿奇霉素和罗红霉

素抑菌性的使用量。
结果表明:大环内酯酶 1 支/皿可消除阿奇霉素和罗红霉素对金

黄色葡萄球菌的抑菌性。因各公司采用的方法及生产工艺的差别，使 用量也有所不同，应以各公司实际验证结果为准。本报告仅供参考。 1.1 胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)

来源:美国 BD 公司 批号:8291964 有效期:2023.08

1.2 大环内酯酶 来源:杭州华原生物科技有限责任公司 批号:200702D
酶活性: 12.6U/支

1.3 供试品

抗生素	厂家	批号
阿奇霉素片剂	XXXX有限公司	20031701
罗红霉素胶囊	XXXX有限公司	97032203

1.4供试菌
金黄色葡萄球菌:CMCC(B) 26003，中国食品药品检定研究院

二、验证目的 采用薄膜过滤法，试验确定能消除阿奇霉素和罗红霉素抑菌性的

加酶量。 三、试验要求

1)供试菌稀释液浓度:≥50 cfu/皿;

2)回收率:50%~200%; 四、实验过程

4.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌至胰酪大豆胨液体培养基中，接种量 5%，

于恒温摇床 37°C培养 18 小时，用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释金黄色葡 萄球菌至 10-7。
4.2 加酶平皿的制备

向大环内酯酶中加入 1 mL 无菌水溶解酶冻干粉，制成酶溶液。

配制 TSA 培养基，121°C高压灭菌 20 min，灭菌结束后将 TSA 培养基放入电热鼓风干燥箱 45°C保温备用。拆开经 121°C高压灭菌 20 min 的玻璃平皿，向平皿中加入大环内酯酶稀释液，然后倒入 TSA 培养基(20~25ml)，轻轻摇晃使酶液与培养基混合均匀。待培养基 凝固后，即制备成添加大环内酯酶平皿:1 支/皿、2 支/皿、3 支/皿。 4.3 阿奇霉素和罗红霉素供试品制备

称量 5g 阿奇霉素，加入 500 mL 的 NaCl-蛋白胨缓冲液，得到 1: 100 的阿奇霉素供试液，静置 1 小时。

称量 10 g 罗红霉素胶囊，加入 90 mL 含 0.1%吐温 80 的无菌

NaCl-蛋白胨缓冲液，混匀制成 1:10 供试液。取 1:10 供试液 80 mL， 加入至 720 mL 含 0.1%吐温 80 的无菌 NaCl-蛋白胨缓冲液，混匀制 成 1:100 供试液，静置 1 小时。
4.4 试验组

4.4.1 将 1mL 阿奇霉素供试液上清加入滤器，然后用 900 mL 的 NaCl- 蛋白胨缓冲液冲洗，最后加入 0.1 mL 菌稀释液用 100 mL 的 NaCl-蛋 白胨缓冲液继续冲洗。取出滤膜，正面朝上贴至已制备好的加酶培养 皿中，32°C培养 24h。

4.4.2 将 1mL 罗红霉素供试液上清加入滤器，然后用 400 mL 的 NaCl- 蛋白胨缓冲液冲洗，最后加入 0.1 mL 菌稀释液用 100 mL 的 NaCl-蛋 白胨缓冲液继续冲洗。取出滤膜，正面朝上贴至已制备好的加酶培养 皿中，32°C培养 24h。

4.5 阴性对照组
使用不加酶普通平皿代替加酶平皿，将 1mL 阿奇霉素和罗红霉

素供试液上清加入滤器，然后用 900 mL 的 NaCl-蛋白胨缓冲液冲洗， 最后加入 0.1 mL 菌稀释液用 100 mL 的 NaCl-蛋白胨缓冲液继续冲洗。 取出滤膜，正面朝上贴至已制备好的加酶培养皿中，32°C培养 24h。 4.6 菌液组

取 0.1 mL 菌稀释液加入滤器，用 100 mL 的 NaCl-蛋白胨缓冲液 冲洗。取出滤膜，正面朝上贴至不加酶普通培养皿中，32°C培养 24 h。 4.7 回收率计算

回收率=试验组菌落数/菌液组菌落数，回收率的值在范围 50%~200%为可接受标准。

五、结论
1)使用薄膜过滤法，大环内酯酶 1 支/皿即可消除阿奇霉素的抑

菌作用。
2)使用薄膜过滤法，大环内酯酶 1 支/皿即可消除罗红霉素的抑

菌作用。

验证结果记录表(一)

抗生素:阿奇霉素片剂
实验组	菌落数			灵敏度回收 率
	皿1	皿2	平均值
菌液组	126	141	133.5	/
阴性对照	0	0	0	/
1 支/皿	99	111	105	78.7%
2 支/皿	118	130	124	92.9%
结果评定	大环内酯酶 1 支/皿可消除阿奇霉素对金黄色葡萄球菌 的抑菌性。

验证结果记录表(二)

抗生素:罗红霉素胶囊
实验组	菌落数			灵敏度回收 率
	皿1	皿2	平均值
菌液组	126	141	133.5	/
阴性对照	0	0	0	/
1 支/皿	118	124	121	90.6%
2 支/皿	130	142	136	101.9%
3 支/皿	135	141	138	103.4%
结果评定	大环内酯酶 1 支/皿可消除罗红霉素对金黄色葡萄球菌 的抑菌性。